Ларри Дэйли, привычный к ночным приключениям в Музее естественной истории Нью-Йорка, сталкивается с самой серьёзной проблемой. Древнеегипетская золотая пластина Ахкменра, источник магии, оживляющей экспонатов, начинает распадаться. Без неё его верные друзья — теди, римский центурион, ковбой Джеремио и другие — навсегда останутся немыми статуями.
Ларри, теперь счастливый отец, снова оказывается на ночной смене в Музее Естественной истории. Его старые друзья — от доисторического человека до Теодора Рузвельта — живут своей насыщенной жизнью, но спокойствие нарушается. В стенах музея, а точнее, в Смитсоновском институте, появляется новая экспонатка — харизматичная и загадочная женщина, которая мгновенно привлекает внимание Ларри.
Бен Стиллер в роли Ларри Старлэнда — человека, который по стечению обстоятельств оказывается ночным сторожем в одном из крупнейших музеев Нью-Йорка. Казалось бы, работа спокойная и предсказуемая, однако уже в первую смену Ларри узнаёт, что после полуночи все экспонаты, от древнеегипетских артефактов до скелета тираннозавра, обретают плоть и кровь.